siRNA 药物研究进展

小核酸药物通过碱基互补配对实现对靶点的限制性选择并直接靶向特定基因,具有较高的特异性,将药物靶点扩大至功能性蛋白质的上游RNA,从转录后水平调控靶基因的表达｡相较于抗体药物和小分子药物,小核酸药物具有靶点丰富､合成方便､临床前研发周期短､不良反应可控等优点｡近年来小核酸药物接连问世, siRNA 药物作为基于RNAi 原理中最常见的解决方案,凭借高特异性和高效性引起人们的广泛关注｡2018 年,美国FDA 批准用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性( hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR) 引起的周围神经疾病的siRNA 药物-patisiran[4],填补了siRNA 药物研发领域的空白,为接下来siRNA 药物的发展开辟了先河｡

近年来,鉴于siRNA 药物广阔的市场和应用前景,以Alnylam 公司､Lonis 公司､Quark 公司为首的研发型公司持续增加对siRNA 药物的研发投入,其领域涉及罕见病､肿瘤､心血管疾病､慢性病､眼科疾病等｡本文讨论了RNAi 的作用机制､siRNA 药物在体内转运时受到的障碍,总结了siRNA 的化学结构修饰策略,并以非病毒载体为重点介绍了目前开发的递送系统｡

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RNAi 的作用机制

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siRNA 成药的关键

siRNA 的结构使其具有一定的免疫原性并容易被核酸酶降解,限制了其在体内的应用｡近年来,研究人员把研究重点放在了siRNA 的稳定性修饰和提高靶向效率上｡一方面,在化学结构上修饰siRNA,增强了体内稳定性和生物利用度; 另一方面,通过构建靶向不同器官或组织的递送系统,高效､安全地将siRNA 传递到靶组织,实现了疾病的针对性治疗｡这些都是siRNA 成药的关键步骤｡

siRNA 的体内不稳定性､脱靶效应以及大剂量产生的免疫原性阻碍了其在体内的应用,主要包括:① 裸siRNA 容易被血液中的核酸酶降解,相对较高的分子量､负电荷和亲水性使其不易透过细胞膜[6]｡② siRNA 容易在肾脏中聚集并随尿液排出体外,或被网状内皮系统捕获,无法有效结合靶点序列发挥作用｡③ 裸siRNA 会引起体内免疫系统的吞噬反应,且属于长度依赖性, siRNA 还可以激活Toll 样受体引发免疫反应｡④ siRNA 能否从内体成功逃逸也影响到其在体内的传递效率｡⑤ siRNA脱靶效应｡这些因素同时阻碍了siRNA 的应用｡

通过对siRNA 进行稳定性修饰,可以提高其在体内的递送效率,进而减少siRNA 的使用剂量以减少免疫原性,此外使用生物信息学方法进行筛选可有效避免siRNA 的脱靶问题｡总之, siRNA 在体内递送时遇到的递送障碍和递送效率低的问题,当前已成为阻碍siRNA 药物发展的瓶颈｡

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siRNA 的稳定性修饰

对siRNA 进行稳定性修饰极大地提高了siRNA在体内的稳定性和利用率,主要包括对糖基､主链､末端和碱基的修饰,在siRNA 的化学结构上提供了以下几种修饰策略[7]｡

3. 1 糖环修饰

在糖环的2' 位置进行修饰,使用最广泛的糖环修饰包括2'-甲氧基修饰( 2'-OME) ､2'-氟嘧啶修饰( 2'-F) ､2'-O-甲氧乙基( 2'-MOE) ,见图2A,能提高结构的耐核酸酶能力和热稳定性[8],同时还可以促进siRNA 与互补mRNA 结合,提高siRNA 的靶向效率｡

3. 2 主链修饰( 也称骨架修饰)

连接RNA 磷酸骨架的磷酸二酯键是核酸酶作用的化学键,将易受攻击的磷原子进行硫代修饰( PS 修饰) ,见图2B,可以提高被修饰物的核酸酶抗性和药动学特性以及血清稳定性,但是高度的PS 修饰会导致严重的毒性效应[9]｡

3. 3 碱基修饰

通过对碱基进行修饰,可以达到加强碱基间相互作用的目的,最常用的碱基修饰手段是在尿嘧啶的5 位点引入溴或碘,如5-溴-尿嘧啶､5-碘-尿嘧啶,见图2C｡

3. 4 末端修饰

末端修饰包括聚乙二醇( PEG) 修饰和胆固醇修饰等,这些修饰通常被引入到正义链末端区域的5'或3' 端,见图2D｡PEG 修饰可以增加粒径､屏蔽负电荷､降低细胞毒性,从而避免siRNA 在体内被核酸酶降解和肾清除,并降低体内毒性[10]｡胆固醇修饰的siRNA 可以延长其在体内的循环时间,增强siRNA 的透膜能力,促进细胞摄取｡

这些稳定性修饰可以提高siRNA 的耐核酸酶抗性､延长半衰期､防止免疫激活､降低脱靶效应并改善药动学和药效学性质｡但稳定性修饰对提高siRNA 靶向递送的效果较差,人们提出了通过递送系统实现siRNA 体内传递的策略｡

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递送系统

SIrna 本身没有靶向性,未经修饰的裸SIrna在体内转染效率较低,无法达到较高的沉默效率｡一些以玻璃体注射[11]和病变部位直接给药[12]的递送方式虽能一定程度解决靶向给药的问题,但不仅给药不便且给患者带来了极大的痛苦｡因此,开发高效的递送系统不仅有助于SIrna 更好地到达靶点,提高其在体内的生物利用度,还有助于提高患者的依从性,更好地造福患者｡

SIrna 递送系统在体内达到理想的传递效果需要具备以下几个特征: ① 较强的稳定性,免受核酸酶､溶酶体的降解破坏｡② 较强的靶向性,可有效到达靶点部位｡③ 安全性良好,避免引起机体免疫反应,避免被网状内皮系统( res) 捕获,延长体内循环时间｡④ 可被细胞高效摄取,且外排量少｡⑤ 可快速释放SIrna,使其在细胞质中发挥基因沉默效应[13]｡递送系统可以分为病毒载体系统和非病毒载体系统两大类｡

4. 1 病毒载体系统

病毒载体的类型包括慢病毒( LENTIVIRUS,lv) ､腺病毒( ADENOVIRUS, aD) 和腺相关病毒( ADENO-ASSOCIATED VIRUS, aav) ,其相较于非病毒载体具有转染效率高､瞬时表达或稳定表达的优点｡但部分病毒载体容易触发免疫原反应,且插入的基因片段易发生突变,具有一定的潜在致癌风险,限制了病毒载体在药物递送中的应用｡目前,病毒载体正朝着降低免疫原性和毒性､增加基因治疗能力的方向发展[14]｡

4. 2 非病毒载体系统

非病毒载体系统种类众多,包括聚合物､脂类､肽､抗体和小分子等｡目前使用最广泛的非病毒载体包括: 纳米载体[脂质体､聚合物纳米颗粒( POLYMER NANOPARTICLES, np) ､脂质纳米颗粒( LIPID NANOPARTICLES, lnp) ]以及SIrna 的缀合物载体( 肽或抗体等) 等,见表1｡

4. 2. 1 纳米载体

基于脂质和聚合物的纳米载体是一类高效的递送系统,可以延长SIrna 在体内的循环时间,提高其稳定性和生物利用度,但同时纳米载体在体内存在转染效率低､血浆清除速度快和具有细胞毒性等缺点[15 - 16]｡

脂质体: 脂质体是一类由亲水核和疏水磷脂双分子层构成的球状载体制剂,具有良好的生物膜性质和包容性,在避免核酸酶降解破坏的同时,促进细胞摄取和内体逃逸｡阳离子脂质体携带的正电荷可以中和SIrna 带有的负电荷,形成具有紧密结构的复合物,从而极大地延长循环时间,促进SIrna 的递送｡未经修饰的脂质体在体内不稳定,易被快速清除,且具有一定毒性,容易引起免疫刺激等,采取适当的手段对脂质体进行修饰可增强脂质体的功能｡例如通过在脂质体表面覆盖亲水性聚合物( 通常为peg) 可以减少脂质体与血清之间的相互作用,避免被res 捕获,在增强稳定性的同时延长体内循环时间[17]｡将脂质体与抗体､多糖､蛋白质等结合,构建配体靶向型脂质体,在提高细胞摄取的同时实现靶向递送,叶酸( FOLIC ACID,fa) -peg-脂质体是最常用的SIrna 肿瘤靶向脂质体之一｡在kHAN 等[18]的研究中,以脂肪酸合成酶( FATTY ACID SYNTHASE,fasn) 作为靶点,通过使用人表皮生长因子受体2( HUMAN EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR-2,her2) 抗体修饰的脂质体包裹SIfasn 抑制了her2 阳性乳腺癌细胞的增殖｡如今,长循环脂质体､抗体修饰脂质体以及Ph 响应型脂质体已成为脂质体核酸递送的主要类型[19]｡

np:np 是一类由多个单体通过共价键连接在一起形成的高分子阳离子聚合物,其突出优势在于既可以将基因浓缩入较小的结构,又可以掩盖SIrna 所带的负电荷,满足SIrna 递送的需求｡其具有较高的包封率,且粒径大小合适､易合成､易降解,此外np 还具有多样的化学结构,可修饰性较强[22]｡聚合物载体还可以克服SIrna 在体内递送时遇到的血清不稳定性､体内屏障､低靶向性等问题[23],已成为一种广泛应用的SIrna 递送载体｡

bEH 等[24]通过使用两亲性共聚物合成的阳离子np将b 淋巴细胞瘤( bCL-2) 的SIrna 递送至hEPg2,hElA,mda-mb-231 细胞系中,可将bCL-2 Mrna 的表达水平下调至10%,充分说明了np 在递送SIrna时所具有的优越性能｡

广泛应用的聚合物载体包括聚乙烯亚胺( POLYETHYLENIMINE, pei) ､壳聚糖和星型聚合物等,pei 凭借其具有的质子化氨基在生理Ph 条件下携带较高的阳离子电荷,可以与带负电的SIrna 形成非共价复合物,表现出优良的递送能力和促内体逃逸能力,在SIrna 递送方面表现出很高的效率｡目前np 正朝着功能性聚合物的方向发展,不同的功能聚合物具有不同的生物信号响应,如Ph､氧化还原､酶､代谢物､光等,且一个np 中可以设计多种生物信号响应位点,满足递送中的不同需求,np 可用于疾病的针对性治疗,提供特异的递送方案,有望成为治疗恶性疾病的智能型SIrna 递送载体[25]｡

lnp:lnp 是一类由中性脂质､可电离的阳离子脂质､胆固醇､peg 等组成的核酸药物递送系统,是目前最具优势的非病毒载体系统之一｡lnp 可以掩盖SIrna 所携带的电荷,避免其被血液中的核酸酶降解,促进内体逃逸｡lnp 的缺点则包括: 不良反应大,易引起过敏反应; 体积大,只能单一静脉给药; 生产工艺复杂｡

lnp-SIrna 系统在临床上得到广泛的应用且效果显著, PATISIRAN 的成功问世将lnp 的发展带上了一个新台阶,它通过静脉注射的方式,将SIrna 靶向至甲状腺素运载蛋白( TRANSTHYRETIN, ttr) ,特异性沉默ttr 的Mrna 并阻断蛋白生成｡在PATISIRAN的临床试验中[26],与安慰剂组相比,给药组患者血液中的ttr 水平明显降低,有效改善了患者的生存质量｡tABERNERO 等[27]为了验证lnp-SIrna 系统在体内的安全性和耐受性,在肝癌患者体内开展了靶向血管内皮生长因子( VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTHFACTOR, vegf) 和驱动蛋白纺锤体蛋白( KINESIN SPINDLEPROTEIN, ksp) 的lnp-SIrna 治疗剂aln-vsp 的Ⅰ期临床试验,发现该系统具有较好的安全性和治疗作用,多数患者病情得到缓解和控制,肿瘤活检发现患者体内vegf-Mrna 明显下调｡

4. 2. 2 SIrna 的缀合物载体

纳米载体在SIrna递送上发挥了巨大作用,但以脂质体和lnp 为代表的递送系统由于粒径大､体内毒性等缺点阻碍了SIrna 药物的进一步发展｡在临床前研究中,SIrna 的递送策略已从复杂的脂质或含有多功能成分的np 逐渐转移到化学定义明确的SIrna 生物缀合物上,包括n-乙酰半乳糖胺SIrna 缀合物( gALnaC-SIrna ) ､细胞穿透肽( CELL PENETRATING PEPTIDES, cpp) 缀合的SIrna 等,目前动态聚共轭物( DYNAMIC POLYCONJUGATE, dpc) ､gALnaC-SIrna 缀合物是比较先进的SIrna 缀合物载体,以核酸修饰和缀合物直接靶向的递送策略成为了SIrna 药物研发的热点｡